Guido Castelnuovo nasce a Venezia il 14 agosto 1865; il padre, Enrico, è conosciuto come scrittore e saggista: da lui il giovane Guido erediterà una solida preparazione umanistica. Studia nella città lagunare e si appassiona alla geometria non euclidea, a quel tempo poco nota in Italia, che rappresenterà per Castelnuovo un fertilissimo campo di ricerche, al quale come studioso darà contributi assai significativi. Nel 1886, presso l'Università di Padova, consegue la laurea in matematica. Il suo maestro, Giuseppe Veronese, gli consiglia di proseguire gli studi a Roma, sotto la guida di Luigi Cremona, la figura italiana più eminente nel campo della geometria.

Dopo un anno passato a Roma, si trasferisce a Torino dove resta per quattro anni come assistente di Enrico D'Ovidio: è un periodo decisivo per l'orientamento scientifico di Castelnuovo, anche grazie al rapporto di amicizia con Corrado Segre. "Passeggiando sotto i portici di Via Po" i due discutono i lavori sulla teoria delle curve algebriche che garantiranno loro in breve tempo una solida notorietà internazionale.

Nel 1891, Castelnuovo vince il concorso alla cattedra di geometria analitica e proiettiva nell'Università di Roma, cattedra che tiene fino al 1935, anno del suo collocamento a riposo per raggiunti limiti d'età. Dopo la morte di Cremona, avvenuta nel 1903, Castelnuovo riforma il corso di geometria superiore dividendolo in due parti; una prima parte fornisce una conoscenza generale degli aspetti della discipline matematiche mentre una seconda, più specialistica, si concentra sulla teoria delle curve algebriche.

Tra i suoi studenti spicca il talento di Federigo Enriques, proveniente dalla Scuola Normale Superiore di Pisa. Il desiderio di Enriques di familiarizzarsi con il nuovo indirizzo di geometria algebrica viene assecondato da Castelnuovo, che ne apprezza il talento e stringe con lui un rapporto amichevole. Il legame tra i due diviene ancor più saldo quando Castelnuovo sposa la sorella maggiore di Enriques. La collaborazione scientifica fra i due porterà nei successivi venti anni di intenso lavoro a una lunga serie di pubblicazioni sulla classificazione delle superfici algebriche. Per i suoi lavori in questo settore Castelnuovo sarà insignito, nel 1895, della medaglia d'oro della Società dei XL.

Pochi anni dopo, nel 1901, Castelnuovo ed Enriques presentano un lavoro congiunto per il Premio Reale per la Matematica conferito dall'Accademia dei Lincei. Premio che verrà assegnato nel 1905 a Castelnuovo e nel 1907 a Enriques.

Dopo gli importanti risultati raggiunti nell'ambito della geometria delle superfici algebriche, Castelnuovo rivolge la propria attenzione ad altre questioni di matematica e di fisica. Pubblica dal 1907 importanti riflessioni sul valore culturale e formativo delle due discipline, quindi dal 1913 si dedica al calcolo delle probabilità, sul quale pubblica nel 1919 un libro che è poi divenuto un testo classico. In seguito si occupa della teoria della relatività di Einstein, e ha un ruolo determinante nella sua diffusione in Italia con il volume Spazio e tempo secondo le vedute di Albert Einstein (1923), e con la voce Relatività (Teoria della) nella Enciclopedia Treccani, oltre che con numerosi articoli e conferenze. Con scritti e recensioni sulla rivista "Scientia" prende parte al dibattito sul determinismo sollevato dalla teoria dei quanti.

Con l'avvento del fascismo, tuttavia, la situazione per Castelnuovo si fa difficile. Amico di Vito Volterra, è attivo oppositore della Riforma Gentile e, dopo il consolidamento del regime, si concentra sull'attività scientifica e universitaria. Le sue ultime pubblicazioni risalgono al 1937 (Memorie scelte di geometria, curate da lui stesso), e al 1938 (Le origini del calcolo infinitesimale nell'era moderna).
Le leggi razziali sembrano ridurlo al silenzio. In realtà egli riesce a portare avanti la sua opera di insegnamento presso l'Università Clandestina, cui dà vita tra il dicembre 1941 e il settembre 1943, per permettere ai giovani ebrei espulsi dalle scuole pubbliche di continuare gli studi. Riesce anche ad ottenere che gli studenti di ingegneria possano proseguire gli studi in Svizzera, presso l'Istitut Technique Supérieur di Friburgo. Dopo l'8 settembre, nella Roma occupata dai tedeschi è costretto a vivere in clandestinità, cercando rifugio presso amici e allievi, rischiando come tutti gli ebrei la deportazione e perciò la vita.

Con la liberazione di Roma nel giugno del 1944 Castelnuovo riprende l'attività pubblica: la sua autorevolezza di ricercatore e di uomo fanno di lui una figura cui affidare la rinascita delle istituzioni culturali italiane, prime fra tutte il C.N.R., di cui è nominato commissario nello stesso 1944, e l'Accademia dei Lincei, di cui segue la ricostituzione tra il 1944 e il 1946. Col ritorno dei Lincei alla normale attività istituzionale, nel 1946 viene eletto presidente dell'Accademia, e tre anni più tardi il Presidente della Repubblica Luigi Einaudi lo nomina Senatore a vita per i suoi meriti scientifici. Muore a Roma il 27 aprile 1952.